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GB／T 41915-2022 纳米技术 MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性.pdf

纳米技术MTS法测定纳米

Nanotechnologies—InvitroMTSassayformeasuringthe cytotoxiceffectofnanoparticles

（ISO19007:2018,IDT)

土地整理(农田水利工程)施工方案言 V 范围 规范性引用文件· 术语和定义… 符号和缩略语 材料 5.1细胞系 5.2检测 ·*.· 5.3对照 纳米颗粒测试样品的制备 ··. 8.1概述 8.2培养基 .......** 8.3配制细胞储备液 8.4验证细胞生长状态 8.5验证酶标仪读数一致性 8.6准备对照实验 8.6.1对照实验说明 8.6.2CdSO储备液的制备(10mmol/L) 8.6.3纳米颗粒对照悬浮液的制备 8.7精确取液... 表征纳米颗粒对细胞活力的影响 9.1概述.. 9.2准备细胞培养板 .*..*. 9.3准备纳米颗粒加样板 9.4细胞在细胞培养液中暴露于纳米颗粒…… 9.5用MTS试剂处理细胞… 9.6测量甲的吸光度 细胞活力分析.. 测试结果解释 甘录A（规范性）可供选择的细胞系和检测方法…….…· "11

本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件等同采用ISO19007：2018《纳米技术MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性》。 本文件做了下列最小限度的编辑性改动： 修改了原文B.2.2.3和C.2.1.2.3的错误编号（见附录B和附录C)； 一 一将C.2.1.2.1、C.2.1.2.3.12中部分内容调整为“注”； 一参考文献重新排序。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国科学院提出。 本文件由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。 本文件起草单位：国家纳米科学中心、上海理工大学、金石包装（嘉兴)有限公司、中国食品药品检定 研究院。 本文件主要起草人：吴晓春、纪英露、黎燕、赵国途、卿前仲、李海芸、文海若、樊慧真。

表1用于制定标准化MTS分析方案的研究总纟

纳米技术MTS法测定纳米 颗粒的细胞毒性

纳米技术MTS法测定纳米

本文件描述了用于评价纳米物体及其聚集体和团聚体(NOAA)对细胞活力影响的MTS方法。此 方法包括操作要求和对照实验，以确定和分析检测结果的不确定性。 本文件适用于96孔板

首选已建立的细胞系，使用时应从有资质的细胞库中获取。用MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性 时，应遵循细胞培养技术的基本原则中关于冻存细胞的扩增操作[15]。 如果需要对细胞系进行储存，应在一80℃或更低温度下使用相应的培养基储存，且培养基中应含 有冷冻保护剂，如二甲基亚矾或甘油。只能在一130C或更低温度下长期储存（几个月甚至长达几年）。 不含支原体的细胞才能用于测试。在使用前，宜测试冻存细胞是否存在支原体。 注1：检测灵敏度可能随细胞传代次数不同而改变，因此有必要定期检查细胞状态[如形态、增殖时间、模态染色体 数目及短串联重复（STR)序列分析J。 注2：纳米颗粒可能通过不同的机制与细胞发生相互作用。因此在细胞选择上包括一个吞噬细胞系（如巨噬细胞) 和一个非吞噬细胞系（如上皮或成纤维细胞)。这两类细胞的测试结果有助于加深纳米颗粒毒性作用机制的 认识。

试剂在细胞酶的作用下被还原成可溶于培养基的显色产物。在没有人为污染的情况下，培养基的 光密度值与培养容器中的细胞数量相关。如果培养条件影响细胞内的还原酶活性，或纳米颗粒在检测 读数中有干扰效应，则可能产生误差。试剂见参考文献，可购自不同的供应商。

5.3.1化学阳性对照材料，CdSO，应作为化学阳性对照。 注1：Cd2+通过氧化应激机制产生动物和细胞毒性，见参考文献[16]。 注2：根据全球化学品统一分类和标签制度（GSH)，水溶性CdCl和CdSO，等含镉化合物标明为危险化学品。 镉是一种有毒重金属，其使用和处理在某些地区有特殊规定。当镉不能作为阳性对照使用时，需要 寻找其替代品。替代品应为水溶性，在实验期间足够稳定，并可从商业供应商处获得纯品。苯酚、二甲 基亚矾等非金属化学品和吐温80等洗涤剂可作为化学阳性对照，但其作为阳性对照还需要提供方案进 行额外的实验验证。 5.3.2带正电的PS纳米颗粒，（直径60nm分散于水中)应作为纳米颗粒阳性对照材料。该颗粒已在 实验室间比对证实可用作A549和Raw264.7细胞的阳性对照（见表1）。 注1：带正电的PS纳米颗粒的分散方法和生物活性，见参考文献[1]。 注2：带正电的PS（胺基化)在许多细胞中引起毒性的氧化应激，见参考文献[17。 注3：石英、氧化硅和银纳米颗粒对很多细胞具有细胞毒性，也可用作阳性对照，见参考文献[18]

化子阳性对照材科，dSO，应作为化字阳性对照。 注1：Cd2+通过氧化应激机制产生动物和细胞毒性，见参考文献[16]。 注2：根据全球化学品统一分类和标签制度（GSH)，水溶性CdCl和CdSO，等含镉化合物标明为危险化学品。 镉是一种有毒重金属，其使用和处理在某些地区有特殊规定。当镉不能作为阳性对照使用时，需要 寻找其替代品。替代品应为水溶性，在实验期间足够稳定，并可从商业供应商处获得纯品。苯酚、二甲 基亚矾等非金属化学品和吐温80等洗涤剂可作为化学阳性对照，但其作为阳性对照还需要提供方案进 行额外的实验验证。 5.3.2带正电的PS纳米颗粒，（直径60nm分散于水中)应作为纳米颗粒阳性对照材料。该颗粒已在 实验室间比对证实可用作A549和Raw264.7细胞的阳性对照（贝表1）

注1：带正电的PS纳米颗粒的分散方法和生物活性，见参考文献[13]。 注2：带正电的PS（胺基化)在许多细胞中引起毒性的氧化应激，见参考文献[17。 注3：石英、氧化硅和银纳米颗粒对很多细胞具有细胞毒性，也可用作阳性对照，见参考文献[18]

6.1 培养箱，37℃士1℃，加湿，5%CO2/空气。 6.2平底96孔板。 6.3 3U形底96多孔板（作为加样板使用)。 6.4 平底24孔板(仅用于细胞培养和增殖)。 6.5 2 96孔板酶标仪。 6.6 1 加速度至少2000g的离心机。 6.72 200μL的多通道移液器（至少8个通道）。 6.8 超净工作台，标准生物安全级别。 6.9 组织培养瓶，25cm²和75cm²。 6.10 倒置相差显微镜。 6.11 体视显微镜。 6.12 实验室天平。 6.13 电子细胞计数器或血细胞计数器。 6.14 微量移液器。 6.15涡旋混合器。

样品制备的基本原则是使用可重复的操作步骤，将纳米颗粒分散在生物相容的液体中。这些操作

步骤包括超声和涡旋混合。此外，也可将纳米颗粒先修饰上具有生物相容性的化学稳定剂和包覆层，如 白蛋白，再进行分散，或直接将其分散于含血清的培养基中。有关分散性的详细信息，参见注释和 ISO/TS19337中引I用的参考文献。 注1：已有一些公开的操作指南用于判定某一方法是否可重复分散纳米颗粒18.19,20]，如何表征纳米悬浮液及其稳 定性。NANOGENOTOX联合行动的分散方法可以从网上获得。 注2：生物相容的化学稳定剂见参考文献[22]。白蛋白包覆见参考文献[23]。生物相容的培养基见参考文献[2]。 注3：化学稳定剂如白蛋白在细胞活力测定时可能引人高的背景值。需要设置对照实验确定稳定剂对检测读数的 影响。 如果纳米颗粒是分散在水等液体介质中，所加介质的体积在细胞培养基中的体积分数应低于其产 生细胞毒性的体积分数。 纳米颗粒悬浮液的液体介质可能对细胞产生毒性并引起假阳性毒性结果。应使用液体介质进行对 照实验以确定多少体积分数的液体介质对细胞有毒。 注：在100μg/mL暴露剂量下，1mg/mL纳米颗粒悬浮储备液中的水在细胞培养基中占约10%的体积。当用水作 为分散介质时，控制最终水量低于10%以免产生显著的溶剂效应。如果因纳米颗粒剂量需要较高的分散介质 浓度时，验证该浓度不干扰测试结果非常重要。 应仔细考虑使用的悬浮方法，以排除非纳米颗粒引起的假阳性细胞毒性作用。 对于纳米悬浮液的稳定性评估，应评估两个因素： a）抗聚集的稳定性（反映在平均颗粒尺寸上）； b）胶体悬浮液的稳定性（反映在沉淀和沉降程度上）。 纳米悬浮液应进行内毒素测试，见GB/T41309

液（培养基除外)及玻璃器血等均应无菌，所有操作均应在无菌条件下和无菌超净工作台（生 主）中进行。

所有溶液（培养基除外)及玻璃器皿等均应无菌，所有操作均应在无菌条件下和无菌 物危害标准）中进行

培养基应无菌。 培养基中无论有无血清都应满足所选细胞的生长要求。如果抗生素对检测没有影响，可在培养基 中加抗生素。 应确定冰箱的温度等储存条件。 注：培养基的稳定性随其组分和储存条件的不同而不同。

使用选定的细胞系和培养基，准备足够的细胞用于完成检测。如果培养细胞取自冻存细胞，先除去 冻存液（如果存在)。在使用前，将细胞至少传代培养一次。 细胞传代培养时，使用适合该细胞系的酶消化和/或机械分离方法进行细胞的分离和重悬。细胞系 信息见附录A。 应采用规范的细胞培养操作。参考文献[15包含更多的指导建议。

8.4验证细胞生长状态

在进行纳米颗粒相关实验之前，每个实验室都应检测细胞的生长状态，即检验和监测细胞活力和增

细胞活力应保持大于95%（通过台盼蓝拒染实验判定）： 使用24孔板培养细胞24h和48h： 1）每孔接种500μL（200000cells/mL)，每个实验组设置8个重复样品； 2）每个时间段(24h和48h)使用一个培养板； 3）将培养板平稳地转移到培养箱中，避免干扰细胞贴壁导致细胞分布不均匀； 4）检查并校准培养箱温度、湿度、CO2浓度等条件，并记录各指标； 5）在每个时间点（24h和48h)，从培养箱中取出一块培养板； 6）用体视显微镜记录细胞的状态和形貌。 5）使用台盼蓝评估细胞数量和活力： 1）轻吸除去孔中的培养液； 2）按照厂家说明书收集细胞； 3）将含有细胞的培养基加人离心管中； 4）在离心机中，将细胞悬液以400g、5min离心形成沉淀； 5）弃去上清液； 6）在100μL培养基中，加人25μL含0.4%台盼蓝的PBS溶液； 7）用移液器吹打细胞沉淀，重悬在台盼蓝/培养基溶液中； 8）将细胞悬液滴在细胞计数器上； 9）用体视显微镜对细胞计数器中的细胞进行计数，记录活细胞和死细胞（蓝色)的总数以及 细胞活力百分数（活细胞数/细胞总数)，见参考文献6； 10）细胞增殖时间应符合该细胞系预期的增殖时间，在纳米颗粒暴露实验前，细胞培养48h 的细胞活力应大于5%。

。细胞活力应保持大于95%（通过台盼蓝拒染实验判定）： a）使用24孔板培养细胞24h和48h： 1）每孔接种500μL（200000cells/mL)，每个实验组设置8个重复样品； 2）每个时间段(24h和48h)使用一个培养板； 3）将培养板平稳地转移到培养箱中，避免干扰细胞贴壁导致细胞分布不均匀； 4）检查并校准培养箱温度、湿度、CO2浓度等条件，并记录各指标； 5）在每个时间点（24h和48h)，从培养箱中取出一块培养板； 6）用体视显微镜记录细胞的状态和形貌。 b）使用台盼蓝评估细胞数量和活力： 1）轻吸除去孔中的培养液； 2）按照厂家说明书收集细胞； 3）将含有细胞的培养基加人离心管中； 4）在离心机中，将细胞悬液以400g、5min离心形成沉淀； 5）弃去上清液； 6）在100μL培养基中，加人25μL含0.4%台盼蓝的PBS溶液； 7）用移液器吹打细胞沉淀，重悬在台盼蓝/培养基溶液中； 8）将细胞悬液滴在细胞计数器上； 9）用体视显微镜对细胞计数器中的细胞进行计数，记录活细胞和死细胞（蓝色)的总数以 细胞活力百分数（活细胞数/细胞总数)，见参考文献6； 10）细胞增殖时间应符合该细胞系预期的增殖时间，在纳米颗粒暴露实验前，细胞培养 的细胞活力应大于5%

8.5验证酶标仪读数一致性

在测定前确保仪器运行正常。

8.6.1对照实验说明

化学阳性对照材料应是CdSO。和带正电的PS纳米颗粒。阳性对照更多的选择细节见5.3。 应单独进行实验以确定纳米颗粒或抗生素是否会对检测产生干扰。 用经过消毒和无内毒素的超纯水（20C时，电导率小于1.1uS/cm）配置储备液。

8.6.2CdSO.储备液的准备（10mmol/L）

处理细胞时，CdSO的浓度应为1μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/ a) 用超纯水溶解并稀释CdSO.至10mmol/L的浓度； b） 将10mmol/L的CdSO保存在4C，无需无菌过滤。

工艺流程-公路设施及预埋管线施工工艺流程图8.6.3纳米颗粒对照悬浮液的制备

用超纯水将带正电的PS纳米颗粒的浓度调整到10mg/mL。 注：在该浓度下，在最大暴露剂量(100μg/mL)时，将在细胞培养基中额外引人1.0%（质量/质量)的水。该储备消 的制备来自附录B中，也将用于下面的实验中。如果储备液中纳米颗粒浓度更低，水在细胞培养基中的浓度会 增加。其他纳米颗粒悬浮液制备见第7章。

表征纳米颗粒对细胞活力的影响

由于纳米颗粒悬浮液可能产生变化，不同时间的3次重复实验应用新配的纳米颗粒悬液。 实验流程如图1所示。

表征纳米颗粒分散体系潜在细胞毒性的简化流程图

.2.1 收集细胞并计数附着式升降脚手架工程安全交底，然后以约7.5×10*cells/mL的密度重悬于培养基中。用细胞计数仪或血球计