标准规范下载简介

JJF(津) 04-2020 实时荧光定量PCR仪校准规范.pdf

3.10荧光强度精密度

3.11阅值循环数*hresholdcycle

3.14熔解曲线*el*curve

sap200标准下载3.15熔解温度漂移*el**e*pera*ure

实时荧光定量PCR仪校准时，根据熔解曲线计算*熔解温度值与光学模拟器熔解 度设定值之差。

3.16峰值强度peakin*ensi*y

熔解曲线上熔解温度对应*荧光强度

熔解曲线上熔解温度对应*荧光强度 3.17通道峰值强度一致性（channel peak in*ensi*y consis*ency，CPHC)

JJF（津）04—2020

表1荧光定量PCR仪计量性能指标

环境温度：（15～30）℃；相对湿度：（2085）%RH。 其它：仪器应远离振动、电磁干扰。

6.2测量标准和其它设备

6.2测量标准和其它设备

光学模拟器集成了温度传感器和发射光发生器两部分。其温度测量范围为（0～ 20）℃，最大充许误差为土0.1℃，发射光发生器*波长范围为（360～780）n*，相 对光辐射强度在（10%～100%）范围内可调

JJF（津）04—2020校准时应采用国内外有证标准物质，包括：质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质，其特性量值（拷贝数≥1o°copies/μL，相对扩展不确定度≤5%）。6.2.3移液器规格：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL，且需要计量检定合格。7校准项目和校准方法7.1校准项目可根据客户要求与实际情况选择光学系统物理校准方法或光学系统生物化学校准方法其中一种对荧光定量PCR仪进行校准。选择光学系统物理方法对荧光定量PCR仪进行校准时，校准项目为温度项目和光学系统物理项目。选择光学系统生物化学方法对荧光定量PCR仪进行校准时，校准项目为温度项目和光学系统生物化学项目。7.2校准方法7.2.1校准前*准备工作将荧光定量PCR仪及光学模拟器各部件连接完好，光学模拟器为集成传感器，下方为温度传感器，上方为荧光发射光源。在光学模拟器下方温度传感器表面上涂抹适量导热油，以确保其与均热块测量孔接触良好。如图2所示，将7个光学模拟器分布于均热块测量孔中。1112BEF图27个光学模拟器位置分布示意图7.2.2校准过程5

JJF（津）04—2020

按照仪器说明书设置校准程序。典型*校准设置程序如表2所示。程序运行结束 后，读取标准值和测量值。校准程序步骤1到步骤3为预热程序，步骤4到步骤11为 温度技术指标校准程序（其中30℃*温度指标测量数据来源于步骤6；平均升、降温 速率*测量数据分别来源于步骤4到步骤5和步骤5到骤6）。步骤12、13为光学模 以器光学扩增程序，荧光定量PCR仪在步骤12和步骤13设定程序之间循环32次。

7.2.3温度示值误差

温度示值误差*计算按照公式（1）计算

式中：△T一采样测量孔温度示值误差，℃；

式中：VuT 一采样测量孔内平均升温速率，℃/s； TB—一90℃温度点所有采样测量孔*温度平均值，℃； TA——50℃温度点所有采样测量孔*温度平均值，℃；

JJF（津）04—2020

平均降温速率是指在温度技术指标校准程序中，荧光定量PCR仪均热块所有采样 测量孔从90℃降温至50℃过程中，单位时间内下降*平均温度值，按公式（5）计算 90℃→50℃*平均降温速率：

7.2.9阈值循环数示值误差、均匀度和精密

阈值循环数C*示值误差*计算按照公式（6）计算，C*均匀度*计算按照公 （7）计算，C.精密度按照公式（8）计算（n为光学模拟器数量，n=7）

式中：△C*i一第i个采样测量孔C*值示值误差： C*qi——第i个采样测量孔荧光信号达到阈值时荧光定量PCR仪实测*C* 值； C*s—一荧光信号达到阈值时光学模拟器实际经历*C*值； △C*uC*值均匀度; C*q*ax 所有采样测量孔荧光信号达到阈值时荧光定量PCR仪实测*C*最 大值； C*q*in 所有采样测量孔荧光信号达到阈值时荧光定量PCR仪实测*C*最 值； RSDc* C*值精密度。

2.10通道峰值强度一致性、线性灵敏系类

JJF（津）04—2020

当DNA循环扩增时从最大荧光强度100%逐渐减弱到20%过程中，理论上荧光定量 CR仪接收到*荧光强度也线性递减。计算熔解曲线上熔解温度（T*）附近*温度点对 应*荧光强度可得到通道峰值强度一致性（CPHC）和线性灵敏系数（LSF），其值分别 按照公式（9）、公式（10）计算：

7.2.11熔解温度漂移和熔解温度比

熔解温度漂移（△T*）*计算按照公式（11）计算，熔解温度比（RT*）*计算 照公式（12）计算。

式中：△T*i一第i个采样测量孔熔解温度漂移，℃； T*i——第i个采样测量孔荧光定量PCR仪实测*T*值，℃； T*s一一光学模拟器*T*设定值，℃； RT*一熔解温度比： T**ax一 所有采样测量孔荧光定量PCR仪实测*T*最大值，℃； T**in 所有采样测量孔荧光定量PCR仪实测*T*最小值，℃； **ax 设定T*时，所有采样测量孔光学模拟器测量*最大温度值，℃； **in 设定T*时，所有采样测量孔光学模拟器测量*最小温度值，℃

7.2.12荧光强度精密度

JJF（津）04—2020

在荧光PCR仪均热块测量孔数量范围内，选取n个测量孔（一般n≥6）。分别将 制高、中、低浓度*标准荧光染料溶液置入选取*测量孔中进行一次测量，光学系 收集各测量孔*荧光强度。按照公式（14）计算荧光强度精密度

式中：RSDF——荧光强度精密度； F第采样测量孔单

F——第采样测量孔单次测得*荧光强度

7.2.13样本测量精密度

选用配套使用*标准荧光染料对高、中、低浓度DNA标准物质进行检测，每一浓 度重复检测6个测量孔，按照公式（15）计算C值*样本测量精密度

式中：RSDs样本测量精密度； S:—第i采样测量孔单次测得*C 值

7.2.14荧光线性相关系数

将已知浓度标准荧光染料梯度稀释后（至少稀释5个梯度）进行测量，每种浓度 重复测量n次取其平均值（一般取n=3），按公式（16）计算线性相关系数rs

式中：F 荧光线性相关系数； 各个浓度梯度荧光奖 xF——各个浓度梯度荧光 Y 一各个浓度梯度荧光

式中：rF 荧光线性相关系数； XFi— 各个浓度梯度荧光染料第次实验*标准值 xp——各个浓度梯度荧光染料n次实验*标准平均值； yi——各个浓度梯度荧光染料第i次实验*测量值； V 一各个浓度梯度荧光染料n次实验*测量值平均值

7.2.15样本线性相关系数

将已知浓度DNA标准物质稀释后（至少稀释5个梯度）进行测量，每种浓度重复 n次取其平均值（一般取n=3），按公式（17）计算样本线性相关系数rs：

xs——各个浓度梯度标准物质n次实验*标准平均值；

经校准*荧光定量PCR仪出具校准证书，校准证书至少 a）标题“校准证书”"； b）实验室名称和地址； c）进行校准*地点（如果与实验室*地址不同）； d）证书*唯一性标识（如编号），每页及总页数*标 e）客户*名称和地址； f）被校对象*描述和明确标识； g）进行校准*日期； h）校准所依据*技术规范*标识，包括名称及代号； i）本次校准所用测量标准*溯源性及有效性说明； i）校准环境*描述： k）校准结果及其测量不确定度*说明； 1）对校准规范*偏离*说明： *）校准证书或校准报告签发人*签名、职务或等效标 n）校准人和核验人签名； o）校准结果仅对被校对象有效性*声明； p）未经实验室书面批准，不得部分复制校准证书*声

建议复校间隔时间为一年。

JJF（津）04—2020

JJF（津）04—2020附录A荧光定量PCR仪校准原始记录参考格式送校信息：送校单位：校准地点：生产单位：规格型号：出厂编号：校准信息：校准证书编号：校准依据：环境温度：℃环境湿度：%RH标准标准信息：标准器名称型号规格出厂编不确定度/证书编号有效日期号准确度等级标准物质名称批号量值特性/型号规格证书编号有效日期不确定度温度示值误差和温度均匀度温度设定温度示值温度采样测量孔实测温度平均值（℃）均匀度误差点(℃)(℃)(℃)(A1)(A7)(A12)(D7)(H1)(H7)(H12)3050 60709095二、温度最大过冲量、平均升温速率和平均降温速率设定温度点(℃)30 5060709095温度最大过冲量(℃)12

JJF（津）04—2020标准物质样本测量不同采样测量孔实测值平均值溶液浓度精密度（%）七、荧光线性相关系数（光学系统生物化学项目）标准荧光荧光线标准实测染料溶液标准值实测值平均值性相关平均值浓度系数八、样本线性相关系数（该光学系统生物化学项目与光学系统物理项目可选择其中一种)样本物质标准实测样本线性标准值实测值溶液浓度平均值平均值相关系数14

C.1温度示值误差不确定度评定

C.1温度示值误差不确定度评定

JJF（津）04—2020

将荧光定量PCR仪及光学模拟器各部件连接完好，光学模拟器为集成传感器，下 方为温度传感器，上方为荧光发射光源。在光学模拟器下方温度传感器表面上涂抹适 量导热油，以确保其与均热块测量孔接触良好。如图2所示，将7个光学模拟器分布 于均热块测量孔中。温度示值误差*计算按照公式（C.1.1）进行计算。

△T一一测量孔内温度示值误差，℃： Ts—测量孔*设定温度值，℃； T一第i个测量孔*测定温度平均值，℃。

C.1.3不确定度来源

根据上述数字模型及测量方法，其不确定度来源主要包括以下三个方面： a）测量重复性引入*标准不确定度u1； b）光学模拟器温度传感器分辨力引入*标准不确定度分量ui； c）光学模拟器温度传感器测温精度引入*标准不确定度分量u2； 各分量中，由于ui和ui存在一定关联，计算中取两者较大者。u2与其它两个分量互 下相关。

C.1.4测量不确定度评定

.4.1重复性测量引起*不确定度分量U

以温度示值误差最大*95℃为例，对同一台荧光定量PCR仪，在相同*测量条件 下，使用推荐*设定程序运行10个循环，温度稳定后7温度传感器*重复测量数据见 表C.1.1。

JJF（津）04—2020

表C.1.1温度测量结果

合并样本标准偏差S，按公式（C.1.2）计算：

*测量点*数量； n每个测量点包含*测量次数： ykj——第j个测量点第k次*测量值，℃; yj——第j个测量点测量值*算术平均值，℃。 通过（C.1.2）计算出合并样本标准偏差如下

S,= 0.152℃

由于每个测量点实际记录1次（n=1），因此重复测量引入*不确定度分量

C.1.4.2光学模拟器温度传感器分辨力引入*不确定度u

Sp 0.152 0.152℃ 11 Vn V

光学模拟器温度传感器*分辨力为0.01℃，分散区间半宽为0.005℃，按均匀 布计算，则

JJF（津）04—2020

由于重复测量引入*标准不确定度分量u大于光学模拟器温度传感器分辨力引入* 准不确定度分量ui，两者具有一定*相关性，因此在不确定度计算时不考虑由读数分 力引入*标准不确定度分量u

.4.3光学模拟器温度传感器引入*不确

C.1.5标准不确定度分量一览表

标准不确定度分量如表C.1.2所示

0.1 0.058℃ V3

表C.1.2温度示值误差测量结果标准不确定度分量一览表

C.1.7扩展不确定度U

取k=2，则：U=k×u=0.33℃

C.2值循环数测量结果不确定度评定

uc=1 Ju + u2 = 0.163℃

将荧光定量PCR仪及光学模拟器各部件连接完好，光学模拟器为集成传感器， 方为温度传感器，上方为荧光发射光源。在光学模拟器下方温度传感器表面上涂抹适 量导热油，以确保其与均热块测量孔接触良好。如图2所示，将7个光学模拟器分布 于均热块测量孔中。阈值循环数C示值误差*计算按照公式（C.2.1）计算。

式中： △C*i——第i个采样测量孔C*值示值误差； 第i个采样测量孔荧光信号达到值时实测*C*值；

式中：n—测量次数； yi——第i次测量值，℃; y——n次测量值*算术平均值，℃； 这里n=10，通过（C.2.2）计算得出：

JJF（津）04—2020

S, = 0.099

由于每个采样测量孔实际测量时只测1次，因此重复测量引入*不确定度分量u1 为：

C.2.4.2光学模拟器分辨力引入*不确定度u

Sp 0.099 11 = =0.099 Vn Vi

0.005 0.003 V

由于重复测量引入*标准不确定度分量u大于分辨力引入*标准不确定度分量ui， 两者具有一定*相关性，因此在不确定度计算时不考虑由读数分辨力引入*标准不确 定度分量u。

C.2.4.3标准器具引入*不确定度u

需要考虑光学模拟器温度传感器最大允许误差引入*不确定度分量u和发射光发 器发光强度测量不确定度引入*不确定度分量UL。 光学模拟器*温度传感器*最大允许误差土0.1℃，最小温度测量点30℃时引入* 确定度最大，PCR扩增光学模拟器*测量平均值为11.5，按均匀分布计算，则：

0.1 UT × 11.5= 0.022 V3×30

光学模拟器*发射光发生器*发光强度可溯源至分光光度计，通过查询，分光光 度计在波长范围（380～860）n*内发光强度*扩展不确定度U=9.5%（k=2），光学模 拟器*测量平均值为11.5，则

由于u和u,之间相互独立，则

9.5% × 11.5 = 0.546 2

u2= /u +u = 0.546

C.2.5标准不确定度分量一览表

DB43／T 1039-2016标准下载标准不确定度一览表见表C.2.2。

JJF（津）04—2020

表C.2.2C*值测量结果标准不确定度一览表

2.7扩展不确定度 L

GBT34482-2017 建筑用铝合金隔热型材传热系数测定方法取 k=2,则: U = k × u.=1.2

uc = Ju + u = 0.555