标准规范下载简介
RBT 033-2020 微生物检测方法确认与验证指南.pdfICS 03.120.00 A00
RB/T033—2020
JC／T 2456-2018 预制混凝土箱涵微生物检测方法确认与验证指南
国家认证认可监督管理委员会发布
范围 规范性引用文件 术语和定义 方法确认 4.1 总则 4.2 特性参数的选择 4.3 确认方式 4.4 特性参数的确认 方法验证 5.1 总则 5.2 特性参数的选择 5.3 定性方法 5.4 定量方法 附录A（资料性附录） 定性方法确认中配对和不配对研究的可接受性限参数和限值 附录B（资料性附录） 根据每个污染水平的阳性结果数量估算LODso
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国合格评定国家认可中心、青岛海关技术中心、大连海关技术中心、深圳华大基 因科技有限公司、浙江天科高新技术发展有限公司、沈阳海关技术中心、辽宁省疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：李宏、唐丹舟、陈延青、姜英辉、单耕、刘淑艳、张娜、李明哲、武维伟、候君钊、 富宏坤、陈欢、付海滨、杨晓婷、孙晓辰、曲晓明、王彦斌
微生物检测方法确认与验证指南
本标准给出了实验室对微 本标准适用于实验室对其制 用的标准方法、扩充和修改过的标准方法 的方法确认，也适用于实验室 方法验证
ISO/EC指南99：2007和TSO/1EC17025：2017界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 方法验证 methodverification 实验室通过核查或试验，提供客观证据证明满足检测方法规定的要求。即提供客观证据以证明实 验室能够正确运用该方法，确保实现所需的方法性能。 注1：适用时，应考虑测量不确定度。 注2：改自ISO/IEC指南99：2007，定义2.44。 3.2 方法确认methodvalidation 实验室通过试验，提供客观证据证明待定方法满足预期的用途。 注1：方法确认宜识别影响方法性能的因素及影响程度，验证方法的性能特性，并确定方法所适用的基质及使用的 限制条件。 注2：确认可包括对抽样、检测物品的处置和运输程序的确认。 注3：改自ISO/IEC指南99：2007，定义2.45。 3.3 参考方法 referencemethod 国际、国家、行业或组织认可并被广泛接受的方法。 注：优先考虑国际标准化组织(ISO)、中国国家标准（GB)、国际分析家协会（AOAC)推荐的方法，其他行业公认方法 也可以作为参考方法。
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实验室应对其制定的方法、超出预定范围使用的标准方法、扩充和修改过的标准方法进行确认。确
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认应尽可能全面，以满足预期用途或应用领域的需要。对于确认过的方法，实验室应制定作业指导书。 实验室应按照技术方案先进行实验室内方法确认研究试验，然后，由协作实验室用相同的样品进行 实验室间协同试验。可采用对待确认方法与参考方法进行比较研究的方式，对待确认方法的特性参数 进行确认。
实验室可在综合考虑成本、风险和技 ，并根据预期的用途来进行方法确认。方法 先应明确检测对象特定的需求，包括样品的特征，数量等，并应满足客户的特殊需要，同时应根据 预期用途，选择需要确认的方法特性参数 典型的需要确认的方法特性参数见表1。
表1典型方法确认参数的选择
4.3.1实验室内方法确认
4.3.1.1一般原则
实验室内方法确认是通过对待确认方法与参考方法进行比较研究的方式DB43／T 351-2019 装配式空腹楼盖钢网格盒式结构技术规程(完整正版、清晰无水印).pdf，对得确认方法的特性参 数进行确认，从而证实该方法的适用性。 对于定性方法，至少需要确认的技术参数包括方法的相对检出水平、灵敏度、包容性和排他性。 对于定量方法至少应确认方法定量限、相对正确度、准确度、包容性和排他性、测量不确定度等技术 参数。
4.3.1.2测试样品的要求
实验室应根据方法规定预期用途，选择基质的种类和类型。测试样品应选择自然污染的样品，如果 无法获得足够数量的自然污染样品，则允许使用人为污染样品。测试样品的基质，应包含不同含量的背 景微生物（高含量，低含量）的样品，不同加工方式的样品，以及原始（未加工）的样品等。 示例1：如果待确认方法仅适用于某类基质，则只需对该类基质进行确认。如果待确认方法适用于多种基质，如食 品，至少选择5类食品，其中每类食品选择不少于3种不同类型样品（如未加工食品、初加工食品及深加工食品等）进行 测试研究，不同类型样品各20份。 示例2；对于定性方法，理想状态是每种类型样品中有10份是阳性样本，10份是阴性样本，至少对于每一类基质，应 没置50%的阳性样本。全部阴性或阳性的样品水平是没有意义的，
RB/T033—20204.3.2实验室间方法确认4.3.2.1一般原则实验室间方法确认是通过不同实验室使用相同的样品进行检测时，比较待确认方法和参考方法特性参数，并将这些结果与待确认方法和参考方法之间可接受差异的限定标准进行比较分析。实验室间方法确认通常由8个协同实验室完成。特殊情况下，至少由5个协同实验室完成。4.3.2.2测试样品的要求由组织实验室制备统一的测试样品，并尽可能结合使用人工和自然污染样品。如没有自然污染样品，可以使用人工污染的样品。基质的选择参见4.3.1.2。对于定性方法，每一种基质至少包括3个测试水平的样本，包括阴性对照和两个测试水平的阳性样品，至少有一个水平的样品设置为获得部分阳性的结果，依据概率分布，理论上，1个菌落形成单位(CFU)/样品的测试水平应获得30%的阴性结果。每个协同实验室需要对每个水平，采用两种方法，进行8次重复试验，即每个协同实验室至少提供48个结果数据（3个水平×2个方法×8次重复）。对于定量方法，每一种基质至少包括3个测试水平，并涵盖方法的测试范围，采用两种方法，每个水平进行8次重复试验，每个样本至少2次重复，即每个协同实验室至少提供48对结果数据（96个结果）。组织实验室负责数据的统计分析，如有证据表明所获结果未严格按照检测方法或不满足检测条件要求，实验室应将该结果剔除。数据剔除后，不需要对离群值进行统计分析。注1：参与实验室间方法确认的实验室，相关的或类似的检测项目建议通过ISO17025：2017认可或具有其他等同资质。注2：用于实验室间方法确认的样本的数量及重复测试数的设计是基于检测方法与结果的准确度的考虑，详见GB/T6379.2。4.4特性参数的确认4.4.1实验室内方法研究特性参数的确认4.4.1.1灵敏度灵敏度测定的目的是确定参考方法和待确认方法之间的灵敏度差异。灵敏度试验的样品一般选择自然和/或人为污染的样品。每类基质种类选择不少于3种不同类型的样品，每个类型测试样品的数量不少于20份。配对比较待确认方法与参考方法，分别按式（1)计算待确认方法（SEat）和按式（2)计算参考方法(SErt)的灵敏度，按式（3)计算待确认方法的相对正确度（RT)和式（4)计算假阳性率(FPR）。(PA+PD)X100%+..........(1)SEref =(PA+ND)(PA + ND + PD)X100%....(2)(PA+NA)RT=NX100%FPFPR=X100%....(4)NA式中：PA一一阳性符合，即两个方法的阳性结果相一致；PD一阳性偏离，即待确认方法为阳性结果，而参考方法为阴性结果；5
ND一一阴性偏离，及待确认方法检出阴性结果，而参考方法为阳性结果； N—样本总数(NA+PA+PD+ND); FP一假阳性结果。 配对和非配对研究的结果用于可接受性限（AL)的评估，分别计算阴性偏离（ND)和阳性偏离（PD） 之差(ND一PD)，配对研究的阴性偏离(ND)和阳性偏离(PD)之和(ND十PD)。方法确认研究的可接受 性限（AL)可参考附录A的表A.1。当结果的计算值高于AL时，则确认结果不满足AL的要求。当 AL不满足时，应对根本原因进行分析，对观察到的结果进行解释。根据AL和附件信息，确认待确认 方法适用或不适用于所分析的基质种类或类别。
4.4.1.2相对检出水平
检出水平(LOD，)是预期可以检测到目标微生物的最低含量。在本标准中，使用LODso对待确认 方法和参考方法的检出水平（LOD，）进行比较研究，并采用相对检出水平（RLOD)对待确认方法进行 评估。 RLOD的研究采用人工污染样品的方式。每类基质种类可选择1种类型的样品，且至少三种污染 水平，其中包括阴性对照，低水平和高水平。理想情况下GB／T 37910.1-2019 焊缝无损检测 射线检测验收等级 第1部分：钢、镍、钛及其合金，低水平应为理论检测水平（即每个测试部分为 D.7CFU），高水平恰好高于理论检测水平（例如每个测试部分1CFU1.5CFU）。对于阴性对照，应采 用待确认方法和参考方法测试至少五个重复样品。对于低水平，至少检测20份重复样品，对于高水平， 应测试至少五个重复样品。阴性对照应为阴性结果，当获得阳性结果时，必须对所有水平重新测试。 RLOD定义为待确认方法和参考方法的检出水平（LOD，）的比率，计算如式（5)所示：