标准规范下载简介
RB∕T 004-2019 转基因检测方法验证指南.pdfICS03.120.20 A00
RB/T004—2019
转基因检测方法验证指南
中国国家认证认可监督管理委员会 发布
“先抽后采”瓦斯治理示范工程监理招标文件RB/T004—2019目次前言引言范围术语和定义缩略语转基因检测方法验证附录A（资料性附录）DNA提取效果的评价方法附录B（资料性附录）DNA提取浓度对实际LOD的影响附录C（资料性附录）中间浓度阳性对照的制备10附录D（资料性附录)基于实时荧光PCR的转基因含量平均值、标准偏差和相对可重复性标准偏差的评估11参考文献15
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京海关、沈阳检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：饶红、韩玥、郭铮蕾、徐姗、李伟、付海滨
RB/T 0042019
本标准的技术内容参考了欧盟联合研究中心(JointResearchCenter，JRC)编写的JRCEUR247 经实验室间确认的转基因检测方法的验证》（VerificationofanalyticalmethodsforGMOtesti n implementing interlaboratoryvalidatedmethods),
本标准给出了转基因检测基因扩增方法的验证与结果评价的指南。 本标准适用于转基因检测实验室对转基因检测基因扩增标准方法进行验证。 注：本标准不涉及对方法特异性和稳健性验证的内容，
下列术语和定义适用于本文件。 2.1 验证verification 提供客观证据，证明给定项目满足规定要求。 [ISO/IEC17025:2017,定义3.8] 注：验证一个实验室能够充分按照标准要求进行操作。需要实验室提供客观证据，证明对于所用的样品基质，能满 足检测方法规定的性能指标。通常，（标准）关键要求是真实度（一般用偏差形式表示）和精确度（一般为重复性 和再现性），反映在测量不确定度中。客观证据是从实验室实际数据中得到的真实度和精确度。 2.2 确认validation 对规定要求满足预期用途的验证。 [ISO/IEC17025:2017,定义3.9] 2.3 定量检测低限 limitofquantification LOQ 是指被检测的样品在合适的精确度水平上能被检测出的最低含量或浓度，并且依据ISO5725条款 [2]或[3]，经过合作实验的满意证明或单一实验室的确认。 [GB/T19495.1—2004,定义 3.1.6] 2.4 检测低限limitofdetection LOD 是指被检测物能够被可靠检出的最低浓度或含量。但是不必进行定量，并且已经经过合作实验的 证明或单一实验室的确认。 [GB/T19495.1—2004,定义3.1.5] 2.5 真实度trueness 大量实验结果的平均值和认可参考值的一致性。 注：真实度（可信度）的量度标准通带是以斜率来表示的。可信度也就是所提到的“平均值的正确度”。 『GB/T19495.1—2004,定义3.1.8]
下列术语和定义适用于本文件。 2.1 验证verification 提供客观证据，证明给定项目满足规定要求。 [ISO/IEC17025:2017,定义3.8] 注：验证一个实验室能够充分按照标准要求进行操作。需要实验室提供客观证据，证明对于所用的样品基质，能满 足检测方法规定的性能指标。通常，（标准）关键要求是真实度（一般用偏差形式表示）和精确度（一般为重复性 和再现性），反映在测量不确定度中。客观证据是从实验室实际数据中得到的真实度和精确度。 2.2 确认validation 对规定要求满足预期用途的验证。 [ISO/IEC17025:2017,定义3.9] 2.3 定量检测低限 limitofquantification LOQ 是指被检测的样品在合适的精确度水平上能被检测出的最低含量或浓度，并且依据ISO5725条款 [2]或[3]，经过合作实验的满意证明或单一实验室的确认。 [GB/T19495.1—2004,定义3.1.6] 2.4 检测低限limitofdetection LOD 是指被检测物能够被可靠检出的最低浓度或含量。但是不必进行定量，并且已经经过合作实验的 证明或单一实验室的确认。 [GB/T19495.1—2004,定义3.1.5] 2.5 真实度trueness 大量实验结果的平均值和认可参考值的一致性。 注：真实度（可信度）的量度标准通常是以斜率来表示的。可信度也就是所提到的“平均值的正确度”。 『GB/T19495.1—2004,定义3.1.8]
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精确度precision
精确度precision 在规定条件下所获得的独立测试结果之间的一致性。 GB/T19495.1—2004，定义3.1.9
清确度precision 在规定务件下所获
本标准包括定性和定量转基因检测方法的验证指标。其中，定性方法指标包括DNA提取和纯化 的验证，DNA浓度的验证，DNA提取物中抑制剂的验证，RSDr的验证，LOD的验证；定量方法指标包 括DNA提取和纯化的验证，DNA浓度的验证，DNA提取物中抑制剂的验证，动态范围、R²系数、扩增 效率的验证，真实度的验证，RSDr的验证，LOQ的验证。
4.2DNA提取和纯化的验证
操作时样品每次分2份，每份至少2次（推荐3次进行DNA的提取，不宜在同一关内进行，应由 不同的操作者完成。提取的DNA应达到一定的浓度和质量标准，DNA提取效果通过验证抑制剂的存 在进行评价，评价方法参见附录A。适用于一种样品基质的DNA提取方法可能不适用于其他基质。 以上步骤需要针对不同样品基质进行。对于DNA提取方法的验证可采用内源基因，因此测试的样品 基质不一定要含有转基因成分。
4.3DNA浓度的验证
实验室在验证过程中，提取DNA的浓度应和标准方法规定的浓度进行比较。实验室提取的DNA 浓度在后续检测时应至少达到规定的LOD/LOQ。实验室提取的DNA浓度对LOD的影响参见附 录B。
PCR分析，每个稀释至少做2个PCR平行实验，从而得到标准曲线。 4.4.2检测抑制剂的PCR实验优先选择内源基因。工作溶液中总的DNA量应至少和方法验证过程 中及日常检测中用的DNA的量相同。 4.4.3当实验室测量C.值和工作溶液推测C，值的平均差值△C，小于0.5，并且抑制剂曲线斜率在 一3.6～一3.1时，即说明DNA提取物中无抑制剂影响。抑制剂实验的示例参见附录A。 4.4.4如果提取的DNA含有抑制剂，要对DNA进一步纯化或过滤稀释到观察不到PCR抑制剂的 水平。
4.5动态范围、R2系数、扩增效率的验证
4.5.1动态范围、R²系数和扩增效率在测量其他参数，如真实度和精确度时，从标准曲线可以自动得 出。应采用至少两条标准曲线的平均值（见表1）。 4.5.2动态范围应覆盖预期值。可用转基因成分百分比或拷贝数范围表示（例如，目标转基因浓度为 0.9%的动态范围是0.09%和4.5%SL191-2008 水工混凝土结构设计规范，目标基因拷贝数为500拷贝的动态范围是50和2500拷贝）。 4.5.3对定性和定量方法，标准曲线斜率的平均值应在一3.6～一3.1，相当于扩增效率在90%到110% 之间。R²系数的平均值应大于或等于0.98。
4.6.1检测条件（反应体积、PCR仪等）应和日常检测一致。至少要得到16个PCR平行的结果。检测 的设计实例见表1、图1和图2。 4.6.2真实度应该接近规定值，或根据方法的预期使用需要，至少接近LOQ的水平。真实度的测量 可以用CRM的至少2个浓度（如0.1%和1%）进行，适用时，用动态范围的上限（如5%）作为第3个浓 度。或者，用一个更高浓度的标准物质配制成低浓度的标准物质（如1%），中间浓度阳性对照的制备方 法参见附录C。基于实时荧光PCR的转基因含量平均值、标准偏差和相对可重复性标准偏差的计算方 法参见附录D。 4.6.3如果没有CRM进行真实度的评估，可以用能力验证样品或能力验证的Z比分数来评价方法的 真实度。 4.6.4真实度的可接受参考值应在±25%之间,或Z比分数在±2之间。
4.7.1实验室可用RSD，来评估方法的重复性。重复性的评估和真实度的评估方法相似，是在重复条 件下通过PCR平行实验进行计算。重复性适用于所有转基因水平的测试。检测条件（反应体积、PCR 仪等)应和日常检测一致，至少要得到16个独立测量结果。检测的设计实例见表1、图1和图2。标准 偏差和相对可重复性标准偏差的计算方法参见附录D。 4.7.2RSD.应小于或等于25%，并覆盖方法的动态范围
4.8.1为了建立准确的LOQrel，需要用低浓度的转基因标准样品提取DNA配制溶液。当实验室验证 LOQre时，0.1%的阳性对照样品可以用目标转基因的10次PCR平行实验和内源基因的10次PCR平 行实验进行分析。LOQrel的RSD应小于25%。 4.8.2当实验室验证LOQ.b时，1%的已知阳性对照样品的一系列稀释可以用10次PCR平行计算（如 80、60、40、20、10、5和1个拷贝）。L0Qbs可以用一系列的稀释液中的最后一个稀释度进行评估，测量 的RSD要小于25%。标准曲线应该覆盖LOQabs值。 4.8.3进行以上两个指标的验证时，概率分布建议1个拷贝应有大约30%的阴性结果。因此，1个拷贝 的稀释液至少一个平行结果应是阴性的。只要标准曲线满足R²和斜率/效率的要求，10次PCR平行
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实验的平均值可作为绘制标准曲线白 标准曲线其他点的数据只需要在每个点做2个 PCR平行实验。当标准方法有规定时 节法规定的要求
4.9.1当实验室验证LOD时，一个低转基因浓度的阳性对照样品可以用10次PCR平行计算，如果 所有平行的结果都是阳性，这表示LODrel小于或等于阳性对照水平。 4.9.2当实验室验证LODabs时，计算一个方法95%置信水平的LODbs，需要每个浓度进行60个PCR 平行。由于此方法并不实用，可用计算少量平行实验的方法进行LODbs的大致评估，如10次平行实验 的假阴性率。假阴性率应小于5%，如进行10个PCR平行实验，其结果应都是阳性。 4.9.3假阴性率是指一个已知阳性样品被检测成阴性的可能性。当分析物的量接近方法的LOD时， 假阴性率会上升。基于对已知方法性能的推测，选取适宜的稀释系列，使其能代表高于和低于预期 LODbs的间隔（如20、10、5和1个拷贝）。10个平行都是阳性的最低浓度是预估的LODbs。概率分布 建议1个拷贝应有大约30%的阴性结果。因此DLT 1100.5-2019标准下载，为了验证稀释系列正确的拷贝数，1个拷贝的稀释液至 少一个平行实验结果应是阴性的，见表1。当标准方法有规定时，LOD应优于方法规定的要求
表1定实时荧光PCR方法的验证设置实例