标准规范下载简介
GB_T 40170-2021 质粒抽提及检测通则.pdfPrinciple of plasmid extraction and testing
国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会
DB41／T 2266-2022标准下载GB/T 40170—202
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、通用生物系统（安徽）有限公司、深圳市分析测 试协会、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、深圳市第二人民医院、成都市食品药品检验研究院、甘肃 省商业科技研究所有限公司。 本文件主要起草人：周李华、雍金贵、王利娜、喻明军、崔康乐、马丽侠、骆晓文、蒋子敬、王维坤、 顾大勇、叶德萍、杨杰、何海宁
本文件规定了质粒抽提及检测的术语和定义、缩略语、原则、抽提、检测、质量控制、样品保存、报告 及废弃物处理。 本文件适用于质粒的抽提及检测
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅 该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB4789.3食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌*计数 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB/T34265Sanger法测序技术指南 GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法
下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）
GB/T 40170—2021
DNase：脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease） HPLC：高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography） RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）
质粒作为基因工程重组技术的常用载体，质粒的质量（浓度、构型、纯度、内毒素含量)是蛋白表达 转染效率的关键。获得高纯度的质粒，需要实验者理解质粒提取原理，针对不同菌种、不同性质 小的质粒·选用恰当的方法·有效地控制提取过程中的各种影响因素
利用离子去污剂、强碱等试剂裂解宿主细胞，使得质粒从细胞中释放出来，再弃除质粒中的蛋白、基 因组DNA等杂质，经异丙醇或乙醇沉淀DNA，最终得到纯化质粒
7.1.2抽提方法分类及特点
表1几种质粒抽提原理及特点
GB/T 40170—202
硅胶柱法抽提操作步骤按照商业吸附柱抽提试剂盒说明书进行。
磁珠吸附法抽提操作步骤按照商业磁珠法
离子交换法抽提操作步骤按照附录B进行
质粒的检测包括液体外观、序列验证、浓度测定、纯度检测、超螺旋比例检测、残余RNA和残余基 因组DNA检测、细菌内毒素检测、限制酶酶切分析、细菌检测等项目，根据不同的项目采用不同的检测 方法。
肉眼观察，参考结果见附
GB/T34265执行，对质粒进行序列测定，参考结
按照GB/T34796执行，参考结果见附录C
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按照GB/T34796执行，OD2so/OD20在1.8至2.0之间，OD26o/OD230在2.0至2.5之间，琼脂糖 泳法检测无其他杂带，肉眼可见，可用于后续试验。参考结果见附录C。
采用高效液相色谱法检测质粒超螺旋比例，利用超螺旋质粒和RNA，基因组DNA碎片的疏水性 质的差异，将待测样超螺旋质粒和其余DNA、RNA分离。方法、设备运行参数按照附录D执行，根据 检测结果计算目标峰面积占所有峰面积的比值。参考结果见附录C。
8.3.6残余RNA、残余基因组DNA的检测
采用琼脂糖凝胶电泳法对残余RNA、残余基因组DNA进行检测，肉眼可见，且限制酶酶切分析 消失。参考结果见附录C
8.3.7细菌内毒素检测
采用鲨试剂检测法检测细菌内毒素，检测方法见中华人民共和国药典：2020年版.四部，细菌内 金查法。参考结果见附录C。
质粒抽提和检测技术人员应由具备分子生物学、微生物学及相关教育背景的人员担任， 涉及质粒抽提及检测的技术人员应该完全了解菌种培养的相关工作，应掌握质粒检测等相关理论 知识和相关试验基础。 检测人员应该接受适当的内部或者外部培训，培训的内容应该包括但是不限于： 菌种培养技术，包括无菌实验室操作技能； 一掌握质粒分子生物学特性； 环境控制； 一定期进行人员的测量能力考核，
质粒抽提和检测技术人员应由具备分子生物学、微生物学及相关教育背景的人员担任。 涉及质粒抽提及检测的技术人员应该完全了解菌种培养的相关工作，应掌握质粒检测等相关理论 知识和相关试验基础 检测人员应该接受适当的内部或者外部培训，培训的内容应该包括但是不限于： 菌种培养技术，包括无菌实验室操作技能； 一掌握质粒分子生物学特性； 环境控制； 一定期进行人员的测量能力考核，
检测仪器应符合预期要求的性能参数和规格。 仪器设备的使用应严格按照标准操作程序进行操作。主要分析设备的操作规程应制定得详细 定期对仪器设备进行检测或校准
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质粒抽提及检测涉及的相关试剂需从具备专业资质并经过验证核实的供应商处采购，且具备检验 合格证明文件。 检测试剂应严格按照使用方法正确使用 检测试剂的使用应具有严格的文件记录制度，包括试剂的标识、使用时间等信息
质粒抽提后应附抽提和检测报告单或等同的指导性文件，格式见附录E。文件内容应至少包括以 下部分： a）名称； b）总量； c）外观； d）浓度； e)OD260/ODzso； ）OD260/ODz30； g）超螺旋比例； h）RNA残留； i）基 基因组DNA残留； j）细菌检测； k）细菌内毒素检测； 1）测序； m）限制酶酶切分析； n)标签； 0）保存条件及期限。
T／CECS754-2020 机动车火灾原因鉴定技术规程及条文说明.pdf弃物处理按照GB/T27403和GB/T19495.2中
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A.2.1分步收集2mL～4mL菌液到2mL离心管中，12000r/min，离心1min，弃上清。 A.2.2向离心管中加人250μL溶液1（已加人RNaseA)，涡旋振荡使细胞重悬。 A.2.3向离心管中加人250pL溶液2，温和翻转离心管6次～10次，使菌体充分裂解，液体变得澄清 A.2.4向离心管中加人350pL溶液3，温和翻转离心管6次～10次，此时可观察到管内出现白色絮状 物，12000r/min室温离心10min。 A.2.5取上清于新的2.0mLEP管中.并记录体积
A.2.6加等体积的苯酚/氯仿溶液，充分振荡混匀，12000r/min离心10min。 A.2.7重复A.2.6。 A.2.8小心吸取上清于新的2.0mLEP管中，加等体积的异丙醇混匀，12000r/min离心10min。 A.2.9小心弃去上清。 A.2.10加入1mL75%乙醇清洗沉淀，12000r/min离心1min，弃去上清。 A.2.11置于超净工作台将残留乙醇吹干，加50μL~100uLddHO溶解，一20C保存。
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B.2.1从转化的细菌平板中挑取单菌落，接种到4mL液体培养基（含相应的抗生素），37C，220r/min培 养6h。 B.2.2取100μL上述菌液接种到300mL选择性培养基中，37C，220r/min，培养16h。 B.2.3收集B.2.2中菌液于500mL离心杯中，4°C，8000g离心10min。 B.2.4弃上清，并倒*在吸水纸上，加人30mL，4°C预冷的BufferP1（已加人RNaseA)，反复吹打沉 淀直至完全混匀。 B.2.5加人30mL细胞裂解液BufferP2，轻柔地上下颠倒混匀4次～6次，在室温下孵育时间不要超 过5min。 B.2.6加人30mL预冷的BufferP3，立即颠倒混匀6次～8次（动作要轻柔），在冰上孵育10min， 4°℃，8000g离心20min。 B.2.7在层析柱的顶端加滤纸，沿滤纸边缘缓慢加人20mL的BufferQBT（平衡层析柱）。 B.2.8将B.2.6中的上清小心移到层析柱中（不可将沉淀绕动），让液体自由流下。
B.2.9加人20mLBufferQC清洗层析柱一次。 B.2.10加人20mLBufferQF洗脱DNA，准备对应的50mL的离心管分别收集洗脱液。 B.2.11加入0.7倍体积异丙醇，上下颠倒混匀，在冰上孵育30min以上。 B.2.124°℃，8000g离心20min。 B.2.13小心弃去上清。注意：不要将沉淀倒掉。 B.2.14加人2mL75%乙醇清洗沉淀，4°℃，8000g离心10min，弃上清。 B.2.15重复B.2.14。 B.2.16置于超净工作台将残留乙醇吹干，加人500uL的TE溶液或灭菌水溶解DNA
隧道辅助措施施工组织设计GB/T 40170—2021