标准规范下载简介

HJ 1190-2021 水质 灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌 黑色变种）的鉴定 生物学检测法.pdf

水质灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定

警告：检测人员应采取必要的生物安全防护措施（包括但不仅限于一次性手套、 护眼镜、鞋套等防护用品）：检测时应做好无菌防护，在无菌操作设备内进行。

生物指示物biologicalindicator 含有对特定灭菌过程具有一定耐受力的活微生物的生物制品。 注：生物指示物为特定灭菌过程是否满足杀灭指定数量微生物的必须条件提供信息，并规定该过程的置信水平

HL11902021

经灭菌处置后含枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的水样通过孔径为0.45μum的滤膜过滤，细菌和芽孢被 截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36℃土1℃培养72h～96h，枯草芽孢杆菌黑 色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜 检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷 和甘露醇TCECS 758-2020 城镇排水管道混接调查及治理技术规程.pdf，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性。

试剂和材料 除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为蒸馏水。 酪氨酸琼脂培养基，见附录A.I。 5.2 营养琼脂培养基，见附录A.2。 5.3淀粉培养基和碘液， 见附录A.3。 5.4 硝酸盐还原培养基和相关试剂， 见附录A.4。 5.5甘油复红肉汤培养基， 见附录A.5。 5.6甘露糖生化培养基 见附录A.6。 5.7 甘露醇生化培养基， 见附录A.6。 5.8 苦杏仁苷生化培养基，见附录A.7。 5.9 革兰氏染色液，！ 见附录A.8。 5.10 芽孢染色液，见附录A.9。 5.11 阴性对照菌：如地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis） 5.12 阳性对照菌：枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilisvar.niger） 5.13枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液：按照《消毒技术规范》2.1.1.2.3（2）的规定制备，也可购买浓 度范围在10°CFU/ml～10°CFU/ml之间的市售枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液。 5.14无菌滤膜：直径50mm，孔径0.45um的醋酸纤维滤膜。 按无菌操作要求包扎，经121℃高压蒸汽灭菌20min， 晾干备用；或将滤膜放入烧杯中，加入实 验用水，煮沸灭菌3次，15min/次，前2次煮沸后需换水洗涤2~ ~3次。也可采用市售的无菌滤膜。 5.15石蜡质封口膜。 5.16无菌水：取适量实验用水，经121℃高压蒸汽灭菌20min， 备用， 注1：5.1～5.10的成分及制备方法见附录A，也可使用市售商品化培养基或染色液； 注2：5.11～5.12，建议购买由国内或国际菌种保藏机构保藏的遗传学特性得到确认和保证并可追溯的标准菌株。

6.1样品瓶：螺口带盖或磨口具塞的250ml、500ml广口玻璃瓶。 6.2恒温培养箱：36℃±1℃。 6.3高压蒸汽灭菌器：121℃，可调。 6.4pH计：准确到0.1pH单位或更高精度。也可使用pH精密试纸。 6.5显微镜：物镜4×或5×、10×、20×、40×，油镜100×，目镜10×或15×。 6.6分析天平：实际分度值0.0001g。 6.7培养皿：直径90mm。

7.1.1评价使用高温高压灭菌设备的灭菌效果时， 样品瓶（6， 口入枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬 液（5.13）及200ml无菌水（5.16）使混合液中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×10*CFU/ml~ 5×10'CFU/ml。灭菌处置完毕后，取出样品瓶，对水样进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种） 的检测。 7.1.2评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液（5.13）加 入灭菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×104CFU/ml～5×105CFU/ml。灭菌处 置完毕后，从灭菌设备中采集水样，进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。采样量一 般为样品瓶容量的80%左右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎样品 瓶。

2评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液（5.13） 菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到5×10+CFU/ml～5×105CFU/ml。灭菌 毕后，从灭菌设备中采集水样，进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。采样量 样品瓶容量的80%左右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎

样品采集后宜在2h内检测，否则应在10℃以下冷藏保存运输，但不得超过6h。实验室接收样品 后，不能立即开展检测的，样品应在4℃以下冷藏保存，并在2h内检测。 注：宜使用生物安全周转箱进行样品周转。

样品中枯草芽孢杆菌黑色变种的检测程序见图1

后，继续抽吸约5s，关闭过滤装置真空泵开关。过滤前按无菌操作要求调节样品的pH值至7.0

8.3.1用无困镊子（6.10）夹取滤膜贴放在酪氨酸璟脂培养基（5.1）上，滤膜截留细菌的一面同上， 另一面应与培养基完全贴紧，滤膜和培养基之间不得留有气泡，然后用石蜡质封口膜（5.15）封闭培 养皿边缘，培养皿倒置放入恒温培养箱（6.2）内，36℃土1℃培养72h～96h。 8.3.2培养72h后，若培养基上有黑色或可疑（灰色、灰黑色）菌落生长，则挑取接种于营养琼脂培 养基（5.2）上，36℃土1℃培养24h，待鉴定，同时将已挑取菌落的酪氨酸琼脂培养基培养皿在2℃~ 5℃储存，以备必要时复查。若培养基上无黑色或可疑菌落生长，则延长培养时间至96h，仍无黑色 或可疑菌落生长，则试验终止。 注：菌落颜色无法判断时，可再次划线接种至酪氨酸琼脂培养基（5.1）培养后观察。

HJ11902021

挑取黑色或可疑菌落（8.3.2），分别使用革兰氏染色液（5.9）和芽孢染色液（5.10）染色，操作 步骤及结果观察见附录B，然后镜检。枯草芽孢杆菌黑色变种革兰氏染色镜检结果见图2a），芽孢染 色镜检结果见图2b）。枯草芽孢杆菌黑色变种为革兰氏阳性菌，营养细胞呈杆状，单个或呈短链状排 列：芽孢中生、椭圆形、不膨大。

a）革兰氏染色0放大1000倍

图2枯草芽孢杆菌黑色变种染色镜检图

挑取黑色或可疑菌落（8.3.2），分别接种到淀粉培养基（5.3）、硝酸盐还原培养基（5.4）、甘油 复红肉汤培养基（5.5）、甘露糖生化培养基（5.6）、甘露醇生化培养基（5.7）和苦杏仁苷生化培养 基（5.8）上，操作步骤及结果观察见附录B，若使用市售商品化培养基， 则按使用说明书操作。

用无菌水（5.16）按照步骤8.2和8.3进行实验室空白对照试验。 培养96h后平板培养基上应无菌落生长，否则，该次样品鉴定结果无效，应查明原因后重新采样 和检测。

8.5.2阴性及阳性对照

将阴性对照菌（5.11）和阳性对照菌（5.12）制成浓度为40CFU/L～600CFU/L的菌悬液，分别 按照8.2～8.4步骤操作。阴性、阳性对照菌呈现的生化反应结果应与表1所列结果一致，否则该次样 品鉴定结果无效，应查明原因后重新采样和检测

HL11902021

表1阴性、阻性对照菌应呈现的生化反应结

6家实验室分别对枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液（以芽孢计）高浓度（10°CFU/100ml）、中浓度 104CFU/100ml）、低浓度（102CFU/100ml）样品进行方法灵敏性检测，结果显示枯草芽孢杆菌黑色 变种的检出率均为100%。

6家实验室分别对枯草芽孢杆菌黑色变种阳性对照组和地衣芽孢杆菌阴性对照组进行方法特异 则，结果显示阳性对照组枯草芽孢杆菌黑色变种的检出率为100%，阴性对照组中枯草芽孢杆菌 中的检出率为0。

11质量保证和质量控制

详品均应进行空白对照试验、阴性对照试验、阳

HJ1190—2021

2每20个样品或每批次样品（≤20个/批）检测一个平行样，若平行样与原样品的结果不一致 本批次试验无效，需重新检测。 3应使用有证标准菌株对每批次培养基进行质量检验。

实验产生的废物经121℃高压蒸汽灭菌20min～30min后，依法委托具备相应资质的！ 置。

HL11902021

A.1酪氨酸琼脂培养基

将除璟脂以外的各成分溶解于蒸馏水申，按配方顺序逐一加入营养成分，待一种成分溶解后加入另 种成分，调节pH值至7.0左右。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化，121℃高压蒸汽灭菌15min。 待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注25ml～30ml培养基，待用。

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融 化，121℃高压蒸汽灭菌15min。待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注15ml～25ml培养

A.3淀粉培养基和碘液

A.3.1.2制备方法

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂 121℃高压蒸汽灭菌20min。待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注15ml～25ml培 待用。

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，调节pH值至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融 化，121℃高压蒸汽灭菌20min。待冷却至50℃～55℃，每个培养皿内分别倾注15ml～25ml培养 基，待用。

碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 ml

A.3.2.2配制方法

将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。

HL11902021

A.4硝酸盐还原培养基和相关试剂

A.4.1硝酸盐还原培养基

A.4.1.2制备方法

A.4.2格里斯氏（Griess）试剂

A.4.2.2配制方法

A.4.3 二苯胺试剂

A.4.3.2配制方法

A.5甘油复红肉汤培养基

A.6甘露糖生化培养基/甘露醇生化培养基

将以上成分加热溶解，调节pH值至7.0～7.2，分装于试管中，培养基高度约4cm～5cm，112 蒸汽灭菌30min。其中，溴甲酚紫（0.04%）配制方法为：称取0.1g溴甲酚紫，滴加0.1mo 瓦化钠溶液1.85ml，使之溶解，然后加蒸馅水定容至250ml

A.7苦查仁苷生化培养基

HL11902021

HL11902021

将以上成分加热溶解，调节pH值至6.06.3，分装于试管中，每管3ml～4ml，121℃灭菌 其中，溴甲酚紫（1.6%）配制方法为：称取1.6g溴甲酚紫，滴加无水乙醇使之溶解，然后 醇定容至100ml。

A.8.1结晶紫染色液

A.8.1.2配制方法

工 A.8.2 单三氏碘液 0 A.8.2.1成分 碘 碘化钾 2.0g 蒸馏水 300ml A.8.2.2 配制方法 将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。 A.8.3 沙黄复染液 A.8.3.1 成分 沙黄 0.25g 95%乙醇 10ml 蒸馏水 90ml

A.8.2.2配制方法

A.8.3.2配制方法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释

A.9.1饱和孔雀绿水溶液

A.9.2.2配制方法

将番红加入蒸馏水中充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水定容至100ml。

HL11902021

附录B （规范性附录） 培养基和染色液使用说明及结果观察

将待检菌接种于淀粉培养基（A.3.1）上，36℃土1℃培养2d，形成明显菌落后，在平板培养基 上滴加碘液（A.3.2）。

B.2硝酸盐还原培养基

当培养液中滴加A液、B液后。溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示有亚硝酸盐存 在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，可滴加1～2滴二苯胺试剂（A.4.3），此时如呈蓝色反应， 则表示培养液中仍有硝酸盐，且无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用，为硝酸盐还原阴性；如不 呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质某苑三期项目18号楼深基础工程施工方案，故仍按硝酸盐还原阳性处理。

B.3甘油复红肉汤培养基

B.4甘露糖生化培养基/甘露醇生化培养基

将待检菌分别穿刺接种于甘露糖生化培养基（5.6）和甘露醇生化培养基（5.7），36℃土1℃ 1d~5d后观察。

B.5苦杏仁苷生化培养基

镜检，菌体呈蓝紫色为革兰氏阳性菌，呈红色为革兰氏阴性菌。

芽孢染色按照以下步骤操作： a）将生有芽孢的菌落涂片，火焰上固定，用饱和孔雀绿水溶液（A.9.1）染色10min，水洗： b）滴加0.5%番红溶液（A.9.2）复染30s，水洗，晾干、镜检。

镜检，菌体呈红色新疆天山汽车综合楼施工组织设计，芽孢呈绿色。